Сергей Головин. Враг моего врага — мой друг. Пожиратели бактерий: убийцы в роли спасителей

«Враг моего врага — мой друг» — это утверждение как нельзя лучше выражает главную причину интереса человека к вирусам бактерий. Фото фагов: Claudius Schulze.

Сегодня в связи с нарастающей проблемой антибиотикорезистентности ученые всего мира ведут поиски новых антибиотиков и способов борьбы с инфекционными заболеваниями. И всё больше ученые оглядываются на естественный, но почти забытый метод — фаготерапию. Бактериофаги — природные враги бактерий, существовавшие задолго до появления человека.

Почему же мы не используем их вместо антибиотиков, которые привели к такой глобальной проблеме, как резистентность бактерий, ну или хотя бы в дополнение к ним? Что это за диковинные создания и могут ли они быть полезны человеку? Безопасны ли они? В этом обзоре мы попытались собрать воедино имеющиеся данные о бактериофагах и показать вам, насколько красив и многообразен их невидимый мир.

ХХ столетие называют веком атома, нейлона и антибиотиков. С началом массового применения пенициллина в 1943 году медики всего мира получили мощнейший механизм для защиты организма от атак, казалось бы, всех болезнетворных бактерий. И ученые, подхватив знамя антибиотикотерапии, ринулись на поиски и разработку новых антибактериальных средств.

Но если мирный атом и синтетические материалы с лихвой оправдали возложенные на них ожидания, то надежды на всемогущество антибиотиков, увы, постепенно тают: резистентность бактерий к ним становится всё шире. 16 сентября 2000 года на Всемирном дне резистентности в Торонто была принята Декларация по борьбе с бактериальной резистентностью [1], а годом позже ВОЗ опубликовала Глобальную стратегию по сдерживанию устойчивости к противомикробным препаратам, в тексте которой есть такие строки: «Без согласованных действий всех стран многие великие открытия, сделанные учеными-медиками за последние 50 лет, могут утратить свое значение из-за распространения антибиотикорезистентности» [2].

Означает ли это, что мы в скором времени вновь окажемся бессильны перед бактериями? Существуют ли альтернативные подходы к борьбе с инфекционными заболеваниями? К счастью, да. Один из них — применение бактериофагов, самых многочисленных, древних и распространенных на нашей планете вирусов [3], существующих на Земле свыше 3 млрд лет и неоправданно заброшенных исследователями в 1960–1970-е годы на фоне успехов антибиотикотерапии.

Открытие

Несомненно, многие бактериологи наблюдали и описывали проявления действия фага на бактериальные культуры. В 1896 году английский бактериолог Э. Ханкин, исследуя антибактериальное действие воды индийских рек, пришел к выводу о существовании агента, проходящего через бактериальные фильтры и вызывающего лизис холерных вибрионов.

По некоторым данным, российский микробиолог Н.Ф. Гамалея в 1897 году наблюдал лизис бацилл сибирской язвы. Однако первая научная публикация о фагах — статья 1915 года английского микробиолога Ф. Туорта, в которой он описал инфекционное поражение стафилококков, значительно изменявшее морфологию колоний.

Инфекционный агент свободно проходил через бактериальные фильтры, и его можно было переносить из одной колонии в другую. Туорт выдвинул несколько гипотез, объясняющих это явление, в частности — гипотезу о фильтрующемся вирусе, подобном вирусам растений и животных. Однако его работа не привлекла внимания ученых, а Туорт забросил ее из-за службы в армии: началась Первая мировая.

В 1917 году канадский бактериолог Ф. Д’Эрелль независимо от Туорта сообщил об открытии вируса, «пожирающего» бактерий, — бактериофага [4]. Микробиологи того времени считали, что чума свиней вызывается совместным действием микроба и вируса. Д’Эрелль предположил, что схожая этиология и у дизентерии. С помощью свечей Шамберлана он отфильтровал фекалии больных дизентерией и добавил их в пробирки с культурами шигелл, намереваясь ввести смесь бактерий и предполагаемого вируса экспериментальным животным.

Однако на следующие сутки он обнаружил, что бульон, в котором росли шигеллы, стал прозрачным, что свидетельствовало о гибели бактерий. Профильтровав бульон из этих пробирок, он снова заразил полученными фильтратами культуры шигелл. И вновь на следующие сутки он обнаружил, что бульон стал прозрачным.

Полученное «литическое начало» можно было бесконечно пассировать от одной культуры к другой, что привело Д’Эрелля к мысли о существовании вируса, разрушающего бактерии. В дальнейшем он обнаружил фаги стафилококка, холерного вибриона и сальмонеллы.

Учитывая эффективность фагов против патогенных микроорганизмов и их широкое распространение в природе, Д’Эрелль предположил, что они играют определенную роль в развитии иммунитета к инфекционным заболеваниям и выздоровлении.

В 1920–1940-е годы было проведено множество исследований по клиническому применению бактериофагов, однако стабильных результатов получено не было, и на Западе бактериофаги стали в основном объектом изучения биологов.

В 1931 году Совет фармации и химии Американской медицинской ассоциации опубликовал обзор 150 работ по фаготерапии, в котором M. Итон и С. Бэйн-Джонс [5] утверждали, что природа фага неживая; возможно, это фермент, и ошибочно связывать воздействие фага на бактерии или его терапевтический эффект с его жизнедеятельностью. Такие выводы способствовали существенному сокращению капиталовложений в исследования по медицинскому применению фагов на Западе.

В СССР в ранние годы бактериофагам уделяли достаточно внимания. В 1923 грузинский микробиолог Г.Г. Элиава, ученик Д’Эрелля, основал в Тбилиси Институт бактериофагов, ставший впоследствии Всесоюзным центром фаготерапии, коллекция которого на сегодняшний день составляет около 3000 фаговых штаммов.

Однако успешное применение антибиотиков в 1960–1970-е годы практически похоронило идеи фаготерапии. Так, например, в Большой советской энциклопедии указано: «Антибиотики и другие химиотерапевтические средства оказались эффективнее фагов, в связи с чем их применение с лечебной целью сузилось».

Происхождение

Вопросом о природе бактериофага задавался еще Туорт в своей первой статье. Д’Эрелль в своем фундаментальном труде выдвинул несколько теорий (гипотез) происхождения фагов, из которых две сохранили значение до настоящего времени: «теория вируса» и «регрессивная теория».

В рамках вирусной теории бактериофаги, подобно вирусам растений и животных, рассматриваются как прямые потомки неких очень примитивных форм, существовавших еще до появления клеток, и представляют собой автономные агенты, являющиеся облигатными паразитами бактерий.

Этой теории придерживался Д’Эрелль в самом начале своих исследований, и ее принимало как нечто само собой разумеющееся большинство вирусологов. Но эта концепция, по сути, мало что дает, так как в применении к вирусам такие термины, как автономность и паразитизм, трудно поддаются определению, а сама гипотеза сложно доказуема, поскольку нет ископаемых останков вирусов, а их родственные связи можно изучать только методами молекулярной филогенетики [6].

Согласно регрессивной теории, фаги постепенно развивались из более сложных форм жизни путем утраты всей протоплазмы, ненужной для присущего бактериофагу способа существования. Эта гипотеза лучше вписывается в современную биологию, так как промежуточные стадии процесса дегенерации довольно легко себе представить, а постепенную утрату бактериями способности к синтезу можно изучать экспериментально.

Вполне возможно, что бактериофаги произошли из примитивного полового аппарата бактерий, первоначально развившегося для передачи генетического материала от одной бактериальной клетки к другой. Это могло бы объяснить, почему некоторые фаги и в настоящее время способны выполнять эту функцию путем лизогенной конверсии.

Теория предполагает, что генетический материал фагов — это редуцированный и модифицированный нуклеоид бактерий, сохранивший гомологию с «прародителем» и потому способный с ним рекомбинировать или даже частично замещать его. Это могло бы объяснить свойства умеренных фагов, способных встраиваться в определенные локусы ДНК клетки-хозяина, становясь частью бактериального наследственного аппарата.

В процессе эволюции умеренные фаги могли путем дальнейших мутаций, влияющих на спектр литического действия [7], необратимо превращаться в вирулентные, поражающие хозяев, с которыми они не имели генетического родства. Согласно этой теории, различные штаммы фагов филогенетически не связаны друг с другом, и определенный фаг даже может быть филогенетически ближе клетке-хозяину, нежели другим фагам.

Отсюда следует, что если данная теория верна, то между бактериофагами и вирусами животных и растений нет никакого родства, а фенотипическое сходство — чисто внешнее, обусловленное сходной экологией.

Тем не менее биоинформатические подходы — сравнения огромных массивов геномов и фолдингов белков, а особенно «архитектуры» фаговых частиц — всё же позволяют находить у бактериофагов, фагов архей и вирусов в целом филогенетически общие признаки [3], [8].

Строение и классификация

На протяжении почти 70 лет бактериофаги, как и другие вирусы, были для биологов такими же невидимыми, как атомы для физиков, в силу их субмикроскопических размеров. И только в 1942 году, с помощью недавно изобретенного (М. Кнолль, Э. Руска, 1931 г.) электронного микроскопа, будущий нобелевский лауреат С. Лурия (Колумбийский университет) и Т. Андерсон (RCA-лаборатория, Камден, Нью-Джерси) получили первые фотографии бактериофага Т2, или «анти-коли РС», как его называли Лурия и Андерсон (рис. 1).

Рисунок 1. Изображения бактериофага Т2, полученные С. Лурия и Т. Андерсоном с помощью просвечивающего электронного микроскопа: а — первая в мире фотография бактериофага (2 марта 1942 г.); б — бактериофаг Т2 в культуре Escherichia coli (2 марта 1942 г.); в — Т2 «крупным планом» (29 марта 1962 г.). [42] (фото а и б)

Фаги весьма разнообразны по морфологии — в отличие от вирусов животных и растений. Все известные в настоящее время вирусы эукариот имеют либо форму многогранника (икосаэдра), либо спиралевидный тип симметрии. Что же касается фагов, то среди них тоже встречаются формы со спиралевидным или кубическим типами симметрии, но подавляющее число изученных к настоящему времени фагов сочетает в одной частице оба типа: кубический — у головки, а спиралевидный — у отростка (рис. 2).

Столь своеобразное строение фагов, отличающее их от других вирусов, объясняется наличием у бактерий ригидной клеточной стенки, которая исключает возможность проникновения вирионов в клетку путем пиноцитоза или виропексиса. Такая структурная особенность бактерий способствовала формированию у фагов других способов инфицирования, что и нашло отражение в их облике.

Рисунок 2. Микрофотография фага Т2, полученная с помощью сканирующего электронного микроскопа.

Именно морфология легла в основу современной классификации бактериофагов. Казалось бы, целесообразнее разделять фаги по принципу их связи с определенным видом микроорганизма, который они поражают, — что и легло в основу первых классификаций.

Но этот принцип не обеспечивает необходимой точности, так как один штамм фага может поражать разные микроорганизмы, то есть иметь широкий литический спектр. И наоборот, один вид бактерий может поражаться несколькими фагами, различающимися между собой по целому ряду свойств, в том числе морфологически, тогда как фаги, активные в отношении разных видов и даже родов микроорганизмов, могут быть морфологически тождественны.

Были попытки классифицировать фаги и по сумме признаков (антигенных, физиологических, биохимических, физико-химических, морфологии негативных колоний, спектру литического действия и т. п.).

С развитием электронной микроскопии появилась возможность классифицировать фаги по морфологии. Дэвид Бредли в 1967 году предложил разделить фаги на шесть морфологических групп: с A по F (табл. 1, рис. 3). Вторая используемая классификация, предложенная А.С. Тихоненко в 1968, объединяет фаги групп D и E в одну (табл. 1, рис. 4). Микрофотографии фагов, относящихся к разным морфогруппам, представлены на рисунках 5 и 6.

Таблица 1. Классификация бактериофагов по морфологическим признакам

Рисунок 3. Схематическое изображение фаговых морфогрупп по Бредли (1967)/рисунок автора статьи

Рисунок 5. Различные морфоварианты бактериофагов (микрофотографии автора статьи)

Большинство фагов состоит из головки диаметром 45–140 нм и отростка («хвоста») толщиной 10–40 нм и длиной 100–200 нм (рис. 7). Так выглядят представители порядка Caudovirales («хвостатых фагов»), и именно их образ обычно извлекается из памяти при упоминании термина «бактериофаг».

Рисунок 7. Схема строения вириона фага семейства Myoviridae

Содержимое головки состоит преимущественно из плотно упакованной молекулы ДНК или (реже) РНК, длина которой во много раз превышает размеры головки и достигает 60–70 мкм (рис. 8), и иногда небольшого количества белка — например, ферментов, которые осуществляют первичную транскрипцию генетического материала фага или способствуют ей.

Капсид представляет собой белковую или (не у Caudovirales) липопротеиновую оболочку, собранную из множества копий одного или двух белков. Капсид может быть икосаэдрическим, сферическим, лимоновидным или плеоморфным [9], и именно он, по сути, определяет размер фагового генома.

Рисунок 8. Микрофотография бактериофага с высвободившейся нитью ДНК.

Отросток представляет собой белковую трубку, окруженную у ряда бактериофагов (семейства Myoviridae, типовой представитель которого — фаг Т4) чехлом, состоящим из сократительных белков, подобных мышечным, благодаря чему он способен сокращаться, обнажая часть стержня. С головкой отросток стыкуется с помощью белкового кольца — «портала» («воротничка»).

На противоположном конце, в основании, отросток содержит лизоцим (как домен белка, пронзающего клеточную стенку), служащий для точечного растворения пептидогликана. Возможно и нахождение в основании отростка АТФазы, обеспечивающей энергией инъекции нуклеиновой кислоты в бактерию [10].

Там же у фагов такого типа имеется гексагональная базальная пластинка с несколькими шиповидными выростами и тонкими длинными нитями, с помощью которых фаг распознает рецепторы «своих» бактерий и прикрепляется к ним.

Нитевидные фаги имеют размеры 8×800 нм и лишены выраженных «органов».

Бактериофаги довольно устойчивы к воздействию различных химических и физических факторов. Они выдерживают колебания рН в пределах 5,0–8,0; большинство резистентно к действию холодных водных растворов глицерина и этанола, а также цианидов, фторидов, динитрофенола, хлороформа, тимола и фенола.

Бактериофаги хорошо сохраняются в лиофилизированном состоянии, но разрушаются при кипячении, УФ-облучении, действии некоторых химических дезинфектантов (в частности, кислот и формалина). Фаги хорошо сохраняются при низких температурах (до −200 °С в глицерине), но быстро инактивируются при 65–70 °С [10].

Взаимодействие с бактериями

Фаги — облигатные внутриклеточные паразиты, так как у них нет механизмов для выработки энергии и рибосом для синтеза белка. Размножение фага происходит только внутри бактерии-хозяина и посредством ее синтетической машинерии.

Важным свойством бактериофагов является их специфичность: фаги могут поражать определенный вид бактерий (моновалентные фаги) или же только избранные штаммы/варианты внутри вида (типовые фаги, например, фаги V. cholerae classica и El Tor), но некоторые не столь разборчивы и поражают бактерий разных видов и даже родов (поливалентные фаги) [11].

Тем не менее очень сложно судить о специфичности фагов в природных условиях, поскольку там действуют многочисленные методологические ограничения и популяционные закономерности, и порой один и тот же фаг можно принять как за «генералиста», так и за «специалиста» [12].

По характеру действия на бактерии различают вирулентные и умеренные фаги.

Взаимодействие вирулентного бактериофага с клеткой происходит по литическому пути и складывается из нескольких стадий: его адсорбции на клетке, проникновения в клетку, биосинтеза компонентов фага и их сборки и выхода вирионов из клетки [13].

Рисунок 9. Адсорбция фага PIcmlclr 100ts на поверхности Yersinia pestis (микрофотографии автора статьи)

Первоначально фаг обратимо, а затем и необратимо прикрепляется к фагоспецифическим рецепторам на поверхности бактериальной клетки (рис. 9). Ими могут быть компоненты пептидогликана и тейхоевых кислот грамположительных бактерий или внешней мембраны (порины, молекулы липополисахарида) грамотрицательных, белки капсул, половых пилей и жгутиков [14].

Например, фаги Т3 и Т7 распознают липополисахарид энтеробактерий, а Т4 — еще и порин OmpC, фаг λ «неравнодушен» к мальтопорину (LamB). Бактериофаги Т2 и Т6 взаимодействуют с поринами OmpF и Tsx соответственно, а многие нитчатые и РНК-содержащие (P17, M12, f2) фаги — с пилями.

Помимо рецепторов, адсорбция фага зависит от рН среды, температуры, наличия катионов и некоторых соединений (например, триптофана для Т2). При избытке фага в окружающей среде на одной клетке может адсорбироваться до 200–300 вирусных частиц [10].

В случае Т4 и подобных энтеробактериальных фагов после необратимой адсорбции в чехле отростка высвобождаются ионы Са²⁺, активирующие АТФазу [10], что вызывает сокращение чехла, проталкивание стержня отростка сквозь внешнюю мембрану бактерии, локальное растворение лизоцимом пептидогликана (муреина) и инъецирование в клетку ДНК вириона.

С момента попадания фаговой нуклеиновой кислоты в бактериальную клетку и до полного созревания в ней вирусных частиц проходит определенный отрезок времени, называемый латентным. Он уникален для каждой системы «бактерия — фаг» и может составлять от нескольких минут до нескольких часов [15].

Введенная ДНК фага вызывает полную перестройку метаболизма бактерии: прекращается синтез ее собственных ДНК, РНК и белков. ДНК бактериофага может начинать транскрибироваться его же РНК-полимеразой — например, фаг N4 впрыскивает этот фермент вместе с ДНК [16]. Или же, как в случае Т4, фаг впрыскивает фермент АДФ-рибозилтрансферазу (продукт гена alt), модифицирующий хозяйскую РНК-полимеразу так, что та переключается на транскрипцию исключительно фаговых генов [17]. Синтезирующиеся мРНК поступают на рибосомы бактерии, которые послушно производят белки бактериофага: ранние (ДНК-полимеразу, нуклеазы) и поздние (белки капсида, отростка, базальной пластинки и др.).

Репликация ДНК бактериофага осуществляется его собственной ДНК-полимеразой. Поздние белки и копии фаговой ДНК объединяются, образуя зрелые инфекционные фаговые частицы [18]. Затем происходит лизис клетки-хозяина: фаговые лизины (гидролазы, а не аминокислоты!) и холины изнутри пробивают отверстия в ее мембране и пептидогликане, и в клетку начинает поступать вода.

В итоге бактерия лопается с выходом зрелых бактериофагов (рис. 10). При этом в зависимости от типа фага количество образовавшихся вирионов будет различным — от единичных частиц до нескольких тысяч.

Рисунок 10. Лизис E. coli и выход фаговых частиц. Справа — зрелая форма бактериофага (микрофотографии автора статьи)

Умеренные фаги проникают в клетку так же, как и вирулентные. Например, фаг Mu инъецирует генетический материал очень схоже с Т4, но базальная пластинка Mu устроена проще, и гомологи ее компонентов обнаружены в инъекционных аппаратах большинства фагов с сократимым чехлом. Более того, подобные компоненты характерны и для бактериальных наномашин вроде системы секреции VI типа и R-тейлоцинов (рис. 11) [19]. Умеренный фаг инициирует лизогенный цикл, при котором он вместо репликации обратимо взаимодействует с геномом бактерии-хозяина, интегрируясь в хромосому (фаг λ), либо поддерживается в клетке в виде низкокопийной плазмиды (фаги P1 и N15) [15]. В первом случае ДНК фага пассивно реплицируется в составе хромосомы. Так или иначе при делении бактерии фаговый геном передается дочерним клеткам. Такое состояние фага называется профагом, в нём вирус может находиться во многих поколениях потомства первой зараженной им клетки. Бактерия, содержащая профаг, лизогенна до тех пор, пока при определенных условиях профаг не активируется и не вступит в литический цикл. Переход от лизогении к лизису называется лизогенной индукцией, или индукцией профага. На индукцию фага оказывают влияние условия внешней среды, состояние клетки хозяина, наличие питательных веществ и т.д.

Но некоторые фаги способны покидать клетку без лишнего шума. Так делает, например, фаг L2, паразитирующий в бактериях рода Acholeplasma, лишенных клеточной стенки (их знаменитые родственники — микоплазмы). Вначале он проходит все стадии, соответствующие определению «литический цикл» — но за исключением собственно лизиса хозяина: вирионы как бы отпочковываются от бактерии, захватывая небольшие участки ее мембраны, которые становятся оболочкой фага. После такого деликатного литического цикла L2 может приступить к лизогенизации [20].

Рисунок 11. Дефектные фаги — пиоцины (бактериоцины Pseudomonas aeruginosa)/ (микрофотография автора статьи)

Многие бактерии (особенно γ-протеобактерии) экспонируют на своей поверхности тейлоцины (tailocins) — «перевернутых безголовых фагов». Эти фаговые хвосты незаменимы в конкурентной борьбе бактерий с близкими родственниками (такие структуры называют бактериоцинами), а иногда служат для поражения эукариотических клеток (PLTS, фагоподобные структуры для транслокации белков).

Гены тейлоцинов бактерии заимствовали у различных профагов семейств Myoviridae и Podoviridae, причем ДНК одной бактерии может содержать несколько генетических кластеров разных тейлоцинов наряду с полноценными родственными либо неродственными профагами, кодирующими все «запчасти» вириона [43].

Размножаться «дефектные фаги» не могут из-за отсутствия головки с ДНК, однако множественные отростки на поверхности клетки-хозяина способны подобно шприцам с токсичным содержимым повреждать клетки жертв.

Продолжение темы в след. статье Сергей Головин. Бактериальный иммунитет: применение бактериофагов в медицине

Источник

Публикация на Тelegra.ph

Подписывайтесь нa наш телеграм-канал @history_eco https://t.me/history_eco

См. еще:

Ключевые слова: бактерии, бактериофаги, микробиологи